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激肽释放酶 4(KLK4)基因干扰对口腔鳞状细胞癌增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及其机制的研究

时间:2018-12-20 20:46来源:硕士论文作者:lgg 点击:
本文是一篇临床医学论文,临床医学根据病人的临床表现,从整体出发结合研究疾病的病因、发病机理和病理过程,进而确定诊断,通过预防和治疗以最大程度上减弱疾病、减轻病人痛苦、恢复
本文是一篇临床医学论文,临床医学根据病人的临床表现,从整体出发结合研究疾病的病因、发病机理和病理过程,进而确定诊断,通过预防和治疗以最大程度上减弱疾病、减轻病人痛苦、恢复病人健康、保护劳动力。(以上内容来自百度百科)今天为大家推荐一篇临床医学论文,供大家参考。
 
前言
 
随着现代社会发展,人们的生活节奏加快,人们的生命健康问题受到诸如食品安全、不良生活习惯及环境污染等多因素的严重影响,并且严重影响人生活质量,造成了近年来恶性肿瘤的发病率逐年上升。口腔鳞状细胞癌(OSCC)是一类极具破坏性且致命的恶性肿瘤,占所有头颈部恶性肿瘤的 24%,成为一个极其严重的公共卫生问题[1]。口腔鳞状细胞癌因为其特殊的解剖位置,常严重影响患者的生存质量且多数预后不良。人们的日常不良习惯,如吸烟和饮酒等是癌症转移的危险因素,而肿瘤的转移是癌症患者面临的一个严重问题[2]。据统计,超过 90%的癌症相关死亡率是由于转移[3]。在口腔鳞状细胞癌当中,有超过 50%的病人出现淋巴结转移[4]。数据表明,发现淋巴结转移的癌症患者的 5 年生存率下降到40%,而出现远处转移的癌症患者的 5 年生存率则低至 20%[5]。人类激肽释放酶基因家族(kallikrein,KLKs)在近年的研究中逐渐被我们熟知,其属于高表达的丝氨酸蛋白酶基因系列。KLKs 是由 15 个不同基因编码的丝氨酸蛋白酶,其定位于人类染色体 19q13.4 上,是一组高度保守的基因结构和蛋白质序列[6]。KLKs 属于丝氨酸蛋白酶家族,并在多个组织器官中表达。在许多生理过程中 KLKs 都扮演着重要角色[7-10]。
最近,KLKs 被报道在肿瘤生长和转移中发挥重要功能[11-13],并被认为是各种癌症的生物标志物[8, 11, 13-16]。许多 KLKs 在各种恶性肿瘤中表现出异常表达,被认为是疾病发展的预后标志。目前的研究表明,KLKs 与口腔鳞状细胞癌(OSCC)密切相关,涉及到肿瘤细胞的增殖、凋亡和转移等诸多方面,而严重影响了人类的生命健康[17]。据报道,KLK5 与口腔癌的转移和扩散有关[18]。而 KLK4 也是人类激肽释放酶基因家族中的一员,研究表明 KLK4 可以在牙成熟过程中消化牙釉质基质蛋白,这表明 KLK4 可以裂解肽键[19]。这一特征对其在恶性肿瘤中的作用可能至关重要。目前研究认为 KLK4 对于恶性肿瘤具有重要的作用,KLK4 可能通过促进细胞增殖、EMT 以及恶性转化等途径促进癌的发生与进展。在 1999年,KLK4 首次由 Stephenson 等在子宫内膜癌 cDNA 文库中发现[20]。对卵巢癌研究显示,KLK4 与卵巢癌进展有关,特别是在晚期浆液性乳头状腺癌中表达明显增强,可以作为浆乳癌诊断和病情检测的候选标志物[9, 14]。另外,KLK4 还在前列腺癌中也被过度表达[16, 21-23],在肿瘤细胞上皮间质转化(EMT)过程和前列腺癌骨转移过程中发挥重要作用[24, 25]。Veveris-Lowe 等研究发现 KLK4、PSA 通过上皮间质转化(EMT)作用促进了前列腺癌细胞的迁移,导致癌症进展,该研究为前列腺癌的远处转移提供了重要证据,并与这些癌症的增殖、转移和预后不良有关[24]。KLK4 在乳腺癌、卵巢癌及子宫内膜癌的高度表达使之成为许多恶性肿瘤的生物学标志物[14, 15, 26, 27]。KLK4 在其他肿瘤如肾癌、喉癌等的发生发展中也起到重要作用[28, 29]。
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第一篇文献综述激肽释放酶(KLKs)研究进展
 
激肽释放酶是一组存在于不同组织和体液中的丝氨酸蛋白酶,最早报道的激肽释放酶是从胰腺组织中分离纯化得到的。激肽释放酶主要分为两类:分别是主要分布于血浆的血浆激肽释放酶和广泛分布于各组织细胞中的组织激肽释放酶。二者不仅在基因结构和分子量等微观形态学上存在差异,更在免疫特征和生物活性等功能方面存在明显不同。有研究表明,血浆激肽释放酶是由机体的肝细胞所产生和释放的,进入血浆后可以通过相关机制调节血管紧张度和机体的炎症过程[37]。血浆中的纤维蛋白是参与溶血和凝血的关键物质,血浆激肽释放酶可释放缓激肽从而参与凝血和溶血过程[38]。另据研究,诸如遗传性血管性水肿,视网膜病变和颅脑血栓等众多疾病也与血浆激肽释放酶的表达显著相关。[39]。我们所谓的人激肽释放酶一般不包括血浆激肽释放酶,而是指组织激肽释放酶[40]。相比血浆激肽释放酶来说,组织激肽释放酶体系相对复杂,且成员众多,而各成员之间不管是基因序列还是蛋白结构等方面高度同源并类似。目前已发现 15 种组织激肽释放酶[41]。组织激肽释放酶(kallikrein, KLK)其属性为蛋白激酶,并隶属于 S1 家族的 A 亚族,目前的研究表明,许多恶性肿瘤的发生、发展及免疫逃逸等生物学行为均与 KLKs 家族成员密切相关,并在其癌症病变组织细胞内发现相关成员的蛋白异常表达。[42]。
 
一人组织激肽释放酶(kallikrein,KLK)基因家族组织
激肽释放酶基因簇位于染色体 19q13.3~13.4,在早期的研究中, 人们一直认为人激肽释放酶基因位点上只 3 个基因:分别是编码胰/ 肾激肽释放酶的KLK1;编码人纤体激肽释放酶的 KLK2;还有编码前列腺特异性抗原的 KLK3(PSA)[43, 44]。而随着研究的深入,人们发现在染色体 19q13.4 区域并非仅有以上三种编码基因,并陆续发现在该染色体区域内的 15 种等位基因,它们之间具有高度同源性,并可通过克隆技术而分别纯化表达。[45]。目前研究表明,组织激肽释放酶的 15 个成员广泛分布于机体各不同组织器官内,虽然他们具有高度同源性,并同属于丝氨酸蛋白系列,但其各自在不同组织内的表达量不尽相同。目前发现 KLK 基因的编码长度非常短小,约 10kb 左右,因此 KLK 不同于其他基因,其内不存在假性基因表达并且排列紧密,相邻最近的是 KLK1 与 KLK15,最远的是 KLK4 与 KLK5,其距离在 1.5kb——32.5kb 之间。高度保守性是 KLK4基因表达方面的最显著特点[6],KLKs 家族成员的基因序列含有 4 个内含子和 5个外显子。其中有三个外显子编码表达机体的三个核心催化氨基酸——组氨酸(His57)、天冬氨酸(Asp102)和丝氨酸(Ser195)。
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二激肽释放酶基因家族 KLKs 在体内各组织中的表达及激素调节
KLKs 在很多组织都有表达,用 RT-PCR 或 Northern blot 等方法检测发现,人类激肽释放酶基因家族广泛表达于机体各个组织器官,但表达量不尽相同。主要表达部位为脑,唾液腺,胰腺,肾脏,前列腺,乳腺,卵巢,睾丸和子宫内膜等[13]。其中,KLK1 在胰腺、肾脏和唾液腺表达水平最高;KLK2、KLK3 在前列腺高表达,在其他很多组织中亦有表达但表达量较低;KLK4 在前列腺、胸腺高表达,在乳腺、甲状腺、睾丸、子宫等低表达;KLK6 在中枢神经系统、乳腺、子宫高表达,在唾液腺、脾、睾丸中低表达;KLK7 在皮肤、中枢神经系统、乳腺高表达,在唾液腺、胸腺、子宫、甲状腺等组织中低表达;KLK8 在中枢神经系统、皮肤高表达,在其他组织中鲜有表达;KLK9 在胸腺、睾丸、中枢神经系统高表达,在乳腺、前列腺、唾液腺低表达;KLK10 在乳腺、卵巢、睾丸高表达,在小肠、肺、结肠、胰腺等低表达;KLK11 在胃、子宫、肺、胸腺、前列腺、脾、肝等高表达,在心脏、乳腺、甲状腺低表达;KLK12 在唾液腺、胃、子宫、气管、前列腺等高表达,在睾丸、胰腺、小肠及脊髓低表达;KLK13 在乳腺、前列腺、唾液腺高表达,在肺、心脏、肾上腺、胸腺低表达;KLK14 仅在中枢神经系统高表达,在乳腺、甲状腺、子宫、结肠等低表达;KLK15 在甲状腺、前列腺、唾液腺中高表达,在肾上腺、结肠及睾丸中低表达[55]。我们可以发现,许多激肽释放酶在内、外分泌相关的器官都有不同程度表达,如乳腺、卵巢、前列腺和睾丸以及唾液腺当中[6, 56]。
..........
 
第三章 KLK4 基因干扰对口腔鳞癌细胞凋亡的影响........43
一流式细胞术AnnexinV/PI 双染检测细胞凋亡.............43
二Hoechst 染色检测凋亡细胞核变化........47
三Western blot 检测凋亡相关蛋白表达水平.......49
四讨论.......6
五小结.......61
第四章 KLK4 基因干扰对口腔鳞癌细胞迁移、侵袭的影响.......63
一划痕实验检测细胞迁移能力.........63
二Transwell(Matrigel 基质胶)实验检测细胞侵袭能力.......66
三明胶酶谱法和Western blot 检测MMP-2、MMP-9 的表达...........71
四讨论.......76
五小结.......77
第五章 KLK4 基因干扰对口腔鳞癌细胞上皮间质转化(EMT)的影响 ........79
一Western blot 检测E-cadherin,Vimentin,N-cadherin 的表达......79
二Western blot 检测EMT 相关蛋白酶uPA,TIMP-1,TIMP-2 的表达....82
三讨论.......85
四小结.......86
 
第六章 KLK4 基因干扰对口腔鳞癌细胞 Wnt/β-catenin 信号通路的影响
 
一 Western blot 检测 Wnt 和 β-catenin 的表达
通过 Western blot 检测 Wnt1 和 β-catenin 蛋白水平。阴性对照组和纯细胞组之间没有明显差异。然而,KLK4 shRNA 组的 Wnt1 水平在 KB 细胞中降低到0.46±0.05,在 Tca-8113 细胞中降低到 0.48±0.06。KLK4 shRNA 组的 β-catenin 蛋白水平也在 KB 细胞中降低到 0.41±0.05,在 Tca-8113 细胞的蛋白水平降低到0.64±0.06。以上结果表明 KLK4 沉默抑制了 Wnt/β-catenin 信号通路的激活。免疫荧光法检测各组 Tca-8113 细胞内 β-catenin 水平,其中 β-catenin 标记为红色荧光;DAPI 标记所有细胞,为蓝色荧光。KLK4 基因抑制组的 β-catenin 表达显著降低。本研究还对β-catenin的表达和分布进行了免疫荧光检测。如上图所示,KLK4沉默后,不管是在 KB 细胞还是 Tca-8113 细胞当中,与纯细胞组和阴性对照组相比,KLK4 shRNA 组细胞的 β-catenin 均呈现低表达。该结果与我们前边 Westernblot 检测到的 β-catenin 水平一致。说明在 KLK4 shRNA 组中,细胞核内的 β-catenin表达比其他两组少,这表明 β-catenin 进入细胞核也受到了 KLK4 shRNA 的抑制。这些结果均提示 KLK4 shRNA 抑制了 Wnt /β-catenin 信号通路。
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结论
 
一、KLK4 基因沉默能够显著抑制口腔鳞状细胞癌细胞的增殖。处于 G1期的肿瘤细胞比例明显增高,从而抑制肿瘤细胞有丝分裂和增殖。说明 KLK4能够促进口腔鳞状细胞癌的增殖,是口腔鳞状细胞癌的增殖因子。
二、KLK4 基因沉默能够显著诱导口腔鳞状细胞癌细胞的凋亡。早期凋亡及晚期凋亡细胞比例显著增加。说明 KLK4 能够抑制口腔鳞状细胞癌细胞凋亡,是肿瘤细胞生长失控的危险因子。
三、KLK4 基因沉默能够显著抑制口腔鳞状细胞癌的转移和侵袭。癌细胞转移和侵袭能力显著下降,说明 KLK4 促进口腔鳞状细胞癌的转移和侵袭。
四、KLK4 基因沉默能够显著抑制口腔鳞状细胞癌的上皮间质转化(EMT)。与 EMT 相关的蛋白表达变化说明 KLK4 促进口腔鳞状细胞癌 EMT。
五、KLK4 沉默抑制口腔鳞状细胞癌 Wnt/β-catenin 信号通路的激活,加入该信号通路激活剂后又可以使 KLK4 shRNA 的作用逆转。说明 KLK4 是一种致癌基因,并可通过 Wnt/β-catenin 信号通路发挥其致癌作用。
六、KLK4 沉默抑制口腔鳞状细胞癌 PI3K/AKT 信号通路的激活,加入该信号通路激活剂后又可以使 KLK4 shRNA 的作用不完全逆转。说明 KLK4 可通过 PI3K/AKT 信号通路发挥其对恶性肿瘤的诱发和促进作用。
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参考文献(略)
(责任编辑:gufeng)
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