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绒泡菌目几种黏菌的培养、代谢产物及其生物药学活性的研究

时间:2018-05-21 20:29来源:硕士论文作者:lgg 点击:
本文是一篇药学论文,药学专业业务培养要求:本专业学生主要学习药学各主要分支学科的基本理论和基本知识,受到药学实验方法和技能的基本训练,具有药物制备、质量控制评价及指导合理
本文是一篇药学论文,药学专业业务培养要求:本专业学生主要学习药学各主要分支学科的基本理论和基本知识,受到药学实验方法和技能的基本训练,具有药物制备、质量控制评价及指导合理用药的基本能力。(以上内容来自百度百科)今天为大家推荐一篇药学论文,供大家参考。
 
前 言
 
黏菌(Myxomycete)是一种兼具原生动物及变形虫特性的真核生物,是自然界中分类地位一直存在争议的较特殊的生物类群。喜欢阴暗、潮湿的环境,大部分以腐木、苔藓、枯枝落叶以及动物粪便作为基物,吸收自身所需的营养物质来完成其从孢子到孢子的个体发育过程。黏菌生长的基物不是主要的营养物质,而主要是这些基物上的微小有机体提供了黏菌行吞噬作用的营养物质,从而营养体得以生长[1]。黏菌原质团在生长的过程中,可以通过核的同步有丝分裂使体型增大,同时也可以在发育过程中与接合子结合,或通过爬行与其它原生质团合并来增大体型[1]。在原质团不断运动和发育过程中,同步有丝分裂会使黏菌的原生质团体型增大从而成熟,在成熟原质团刚刚形成疣突时,即在孢囊初形成期,随着孢丝的发育,将要形成孢子的原质团割裂成小段,割裂后约 18-30h,在孢囊内发生减数分裂,从而形成单核单倍体的孢子,这些都是孢子形成的重要阶段。黏菌的培养包括:湿室培养、悬滴培养、有饲培养[2]。由于黏菌孢子可通过风、水和包括节肢动物在内的动物活动等各种各样的途径从孢子体中释放出来,在条件适宜的情况下便会萌发,通过细胞不断的分裂和融合,形成肉眼可见的营养体—原质团,在温度、湿度和光照等条件下,可生长为微小的肉眼可见的子实体。因此采用湿室培养的方法可补充黏菌野外采集过程中丰富度的不足。悬滴培养可观察孢子的萌发情况以及黏变形体和游动胞的运动及变化情况。有饲培养是获得黏菌从原质团到子实体的重要手段。三种方式的结合,便会观察到黏菌在整个生活史中的形态变化特征。同时,黏菌生活史的研究在黏菌的发育过程中需要不同的营养物质来维持其机体的生长,这些营养物质以糖类和蛋白质为主,研究发现,细菌等微生物是黏菌行吞噬功能的主要对象,但黏菌不适宜在牛肉膏、蛋白胨等培养基上生存,而在一些蔬菜、谷物上的生长状态相对较好。不同种黏菌在含不同成分的培养基上原质团生长状态存在差异,因此选择合适的培养基是获得大量原质团的前提。
黏菌同大多数菌物一样,在自身增长的同时会产生许多代谢产物,日本学者通过成功萌发野外采集的 100 多种黏菌孢子,并培养其原质团,开展了黏菌代谢产物的研究[3]。Tran等[4]的研究表明多头绒泡菌(Physarum polycephalum)在自身增长的同时可积累大量的脂质,且这些脂质可以用来生产生物柴油,说明黏菌的代谢产物可作为一种既节约成本又保护环境的可再生资源。黏菌具有建立高效运输网络的能力,通过对其进行算法模拟,证明了其可用来优化交通铁路网络[5]。黏菌的这些特征与其代谢产物有关,而黏菌在生长发育的过程中产生哪些代谢产物,这些代谢产物都具有哪些作用,是否具有生物学活性或其它应用价值,并且不同种黏菌间所产生的代谢产物是否有差异,这些问题还不得而知。由于黏菌个体微小而又难于大量培养,也使得其代谢产物的研究较为缓慢,直到近年有学者筛选出多头绒泡菌(P. polycephalum)的最适生长条件[6],促进了代谢产物的研究。迄今为止已报道了从 5 目 34 种黏菌中获得的 100 余个天然代谢产物,包括脂肪酸、氨基酸、生物碱、萘醌、芳香族化合物、萜类化合物、酯或其衍生品等。部分代谢产物显示了抗菌活性、抗肿瘤活性、细胞毒活性、抗氧化活性。因此,在黏菌中存在的未知的化合物还需要我们进一步的去研究。
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第一篇 文献综述
 
第一章 黏菌的培养
黏菌在真核生物中是一个独立的类群,兼具原生动物和真菌的特征[7]。由于在其生活史中包括一段以类似于变形虫形态生存的黏变形体时期,说明了黏菌具原生动物的特征,而在营养生长阶段,非细胞结构的原质团表面的原生质鞘与多核真菌菌丝的细胞壁表现为同源,同时黏菌在繁殖阶段所形成的子实体和孢子均说明了其具有与真菌相似的特征。
 
1.1 黏菌的生活史研究
自 1901 年[8]首次报道了黏菌的生活史以来,至今已在培养基上完成了 100 多种黏菌的生活史在实验室内培养的研究[9-12]。 而在 19 世纪 50 年代,一份关于紫红半网菌(Hemirtrichia vespurium)孢子萌发的报道,开启了学者们对黏菌孢子萌发以及后续生活史的研究。直至 20 世纪 20 年代,研究人员通过实验室研究发现,不同种黏菌在孢子萌发的过程中所需要的条件存在差异[13],其适宜温度范围在 20-36℃之间[14]而通过化学试剂诱导或弱酸性的条件可促进孢子的萌发[13]。孢子萌发的方式分为开裂式和孔出式。有报道称,纤维素酶可以使开裂式变为孔出式[15]。但至今国内外所面临的问题是如何使孢子壁破裂,从而释放出黏变形体,以保证对其后续生物学方面研究的进行。黏菌的孢子萌发后可释放出黏变形体,经过一段时间黏变形体可转变成能够游动的具鞭毛的游动胞,而彼此之间转换是否发生,取决于孢子生存环境中水分是否充足。当水分充足时,黏变形体会转变成具鞭毛游动胞,而水分缺乏时则又会转变为黏变形体。当黏变形体或游动胞达到一定数量并相互接触后,会产生性结合形成合子,而大量实验证明:多数黏菌仅具有同宗配合或异宗配合,但也有不少种同时具有同宗配合和异宗配合[2]。经配合后形成的合子通过连续分裂会形成双核的体型微小的幼原质团,幼原质团极易与同一株系的其它原质团或合子联合,从而增加大小,这些联合体可能是营养体的,并无核融合。de Bary[16]认识到来自不同黏菌的原质团不管怎样都不会发生联合,这一点已得到了频繁的证实,因而使得人们在无法确定两个物种是否为同一物种时,曾采用联合实验这种方法来确定种。原质团经过同步有丝分裂或与合子结合使体型增大,具有迁移、融合和吞噬等特征。原质团包括流质和胶质两部分,流质部分通常形成错综分叉的网体在原质团的胶质部分中流动,其中具有典型真核细胞中的各种细胞器。这一时期为黏菌的营养生长阶段,当遇到不良的环境时,原质团会纠结聚集到一起,形成坚硬的角质硬块—菌核,当条件适宜时,又会恢复生长为原质团[2]。当原质团遇到适当光照或饥饿条件时,便会形成子实体,即完成其整个生活循环。
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1.2 黏菌优势培养基的筛选
研究在对黏菌进行的大量研究中,对其营养生长阶段的研究也受到广泛的关注,其营养生长阶段受周围环境影响较大,如温度、pH 值、O2和营养物质等,因此许多学者对不同种黏菌在不同培养条件下的生长状态进行了大量的研究。陈小姝[17]对 8 种绒泡菌目黏菌原质团进行了液体发酵培养,采用正交试验法,对培养温度、pH 值和摇床转速进行筛选,成功筛选出了 8 种原质团的最适液体培养条件。谷硕[18]对 12 种黏菌原质团在松针固体培养基、微量元素固体培养基、木耳固体培养基、燕麦固体培养基上的生长状态进行观察,分别确定了 12 种原质团在这几种培养基中的最适培养基。姜宁[19]对 5 种黏菌原质团进行了其对糖类趋化性的研究,结果表明,不同黏菌对糖类具有不同的趋化性,而且通过聚类分析表明,这种趋化性可表现出黏菌亲缘关系的远近。
..........
 
第三章 绒泡菌目黏菌脂溶性代谢产物的分析 .......25
3.1 材料和方法.... 25
3.2 实验结果........ 26
3.3 讨论........ 31
3.4 小结........ 31
第四章 大孢钙皮菌原质团代谢产物的分离与鉴定 .......33
4.1 材料和方法.... 33
4.2 实验结果........ 34
4.3 小结........ 37
第五章 大孢钙皮菌原质团甲醇和石油醚提取物的抗肿瘤活性研究 ...........38
5.1 材料和方法.... 38
5.2 实验结果........ 39
5.3 讨论........ 42
5.4 小结........ 42
 
第五章 大孢钙皮菌原质团甲醇和石油醚提取物的抗肿瘤活性研究
 
关于黏菌的许多报道均证明黏菌中存在许多具有抗癌活性的成分。Ljubimova 等[70]从多头绒泡菌(P. polycephalum)中高度纯化分离得到的 β– L–苹果酸通过共价结合方式形成的结构 Polycefin,通过血液系统和免疫系统实验数据证明了这种药物对人的乳腺癌细胞具有靶向性和高效性且无副作用[71]。本章主要对大孢钙皮菌(D. megalosporum)甲醇和石油醚提取物进行了对 4 种肿瘤细胞的抗肿瘤活性的研究。两种贴壁细胞在 1-2 天内可长满整个培养瓶瓶底,此时需对细胞进行传代培养。将培养瓶内的培养液倒出,加入 2ml PBS 缓冲液清洗培养瓶底部 2 次。洗去残留物和死细胞后,加入 1ml 含 EDTA 的胰蛋白酶消化液于培养箱中消化 1min,迅速再向其中加入含血清的细胞培养液 2ml 终止消化,1000rp/min 离心 5min,传入新的细胞培养瓶中培养。
.........
 
结 论
 
采用湿室培养、悬滴培养和有饲培养相结合的方法,记录了绒泡菌目绒泡菌属的刚丝绒泡菌和钙皮菌属的鳞钙皮菌不同时期的形态变化过程,以及各时期的形态建成上存在的差异。结果证明:由于培养条件的单一,如营养物质、温度、光照、水分等培养条件不能满足黏菌的生长需要,导致 2 种黏菌在实验室培养条件下形成的子实体均与自然条件下所形成的子实体存在差异,这也证实了不同种黏菌间差异是明显存在的。两种黏菌在形态上显示出了明显的差异,同时在形态发生上也显示出了很大的差异。证明了两种黏菌在孢子萌发时间,原质团形成时间,营养体阶段原质团的颜色,子实体的形成所需时间及条件等方面存在的不同。通过对比分析3种黏菌鳞钙皮菌、大孢钙皮菌和光皮煤绒菌在6种不同谷物(高粱米、大黄米、燕麦、荞麦、玉米、薏米)培养基上生长 10d 后的状态。从扇面面积上看,鳞钙皮菌表现为:大黄米>高粱米>燕麦>薏米>玉米>荞麦;大孢钙皮菌表现为:燕麦>玉米>薏米>大黄米>高粱米>荞麦。光皮煤绒菌表现为:大黄米>燕麦>玉米>高粱米>薏米>荞麦。大黄米而从扇面前缘浓密程度上看,鳞钙皮菌表现为:大黄米>高粱米>燕麦>薏米>玉米>荞麦。光皮煤绒菌表现为:大黄米>燕麦>玉米>高粱米>薏米>荞麦。大孢钙皮菌表现为:燕麦>玉米>薏米>大黄米>高粱米>荞麦。扇面面积和前缘浓密程度的结果一致。因此说明在以后对原质团的培养过程中,当想要获得大量原质团,鳞钙皮菌和光皮煤绒菌可采用大黄米固体培养基,而大孢钙皮菌可采用燕麦固体培养基。采用GC-MS法分析6种黏菌脂溶性代谢产物得出,几种供试黏菌原质团中含有酯类、酮类、醛类、醚类、烷烃类、萜类以及甾醇类成分。从煤绒菌石油醚提取物中鉴定得出23 个脂溶性代谢产物,从光皮煤绒菌石油醚提取物中鉴定得出 16 个脂溶性代谢产物,从大孢钙皮菌石油醚提取物中鉴定得出 42 个脂溶性代谢产物,从鳞钙皮菌石油醚提取物中鉴定得出 15 个脂溶性代谢产物,从刚丝绒泡菌石油醚提取物中鉴定得出 12 个脂溶性代谢产物,从鳞皮菌石油醚提取物中鉴定得出 13 个脂溶性代谢产物。不同种黏菌具有产生相同类型脂溶性代谢产物的能力,同时根据亲缘关系的远近进行分析,相近种具有合成相同代谢产物的能力。利用超声波提取法、索氏提取法和重结晶法对大孢钙皮菌原质团干品的代谢产物进行了提取分离,重结晶法从大孢钙皮菌原质团中分理出两种化合物,化合物 1 为豆甾醇,化合物 2 为乳酸。两种化合物均为从此种黏菌中首次获得。因此在以后关于黏菌的代谢产物的研究中,还要找出更合适的分离方法,获得更多的代谢产物,从而为对黏菌的研究提供可靠的依据。
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参考文献(略)
(责任编辑:gufeng)
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