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胶原涂覆聚乙丙交酯/羟基磷灰石支架结合医学DGEA肽协同修复颅骨缺损

时间:2018-11-20 20:56来源:硕士论文作者:lgg 点击:
本文是一篇医学硕士论文,医学专业硕士是为培养医学职业高层次专门人才而设立的专业硕士学位,一般要求学员具有一定得职业背景和一定年限的工作经历(工作经历年限要求多为5年)。
本文是一篇医学硕士论文,医学专业硕士是为培养医学职业高层次专门人才而设立的专业硕士学位,一般要求学员具有一定得职业背景和一定年限的工作经历(工作经历年限要求多为5年)。(以上内容来自百度百科)今天为大家推荐一篇医学硕士论文,供大家参考。
 
第 1 章 绪论
 
1.1 组织工程
组织工程(Tissue Engineering)最早由 Y. C. Fung 教授提出[2],由 Joseph P.Vacanti 和 Robert Langer 两位教授正式建立并进行探索研究,在 1993 年共同发表在《Science》 的文章中将组织工程明确定义为:一种通过整合工程学、生命科学以及医学的原理和方法来制备生物替代物以达到恢复、保持或改善病变组织或器官功能[3, 4]。如图 1.1 所示[1],由于天然生物组织是由细胞、细胞外基质和信号系统构成,相应的组织工程也有三个重要部分组成,即种子细胞、生长因子以及组织工程支架材料。组织工程的基本原理和过程[5]:将从患者身体中提取的种子细胞种植到可以降解的生物支架上,并将生长因子配伍使用进行体外构建。在细胞完成粘附、迁移、生长和增殖后得到相应的细胞/可生物降解支架复合物。然后将体外构建的复合体植入患者创伤或病变器官缺损部位。随着细胞的进一步增殖和分化,组织工程支架材料完全降解并被人体代谢吸收。最终在病变部位形成形状、结构以及功能与目标组织或者器官一致的生物替代物,维持或者改善生物功能。组织工程的提出主要用于解决组织、器官移植来源以及免疫排斥等诸多问题。1980s -1990s被认为是组织工程学的狂热年代“go-go years”,但是组织工程学在商业应用中仍遭遇了诸多问题[6]。Langer 将这些挑战归纳为以下几个方面[7]:1.缺乏可再生的免疫相容的功能细胞源;2.缺乏具有优异的机械、化学、以及生物学等综合性能的生物材料;3.难以获得与具有结构复杂组织的宿主循环系统相容的大尺寸血管化的人工组织。在过去的几十年中,由于科技的创新,组织工程学得以举世瞩目的发展,大量的科学研究关注于解决上述的挑战。在 Langer 和 Dr. AliKhademhosseini 最近发表在 Nature Protocols 的综述中将组织工程学划分成三部分:工程细胞、工程材料、工程组织构建[8]。
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1.2 骨组织工程
骨组织在人体内承担诸多重要功能:提供肌肉和其他组织附着的框架、支持身体运动、保护内部器官、生产血细胞、保持钙稳定和酸碱缓冲作用[12]。许多骨组织相关的疾病,包括骨关节炎、成骨不全、外力创伤等,会影响肌肉骨骼系统功能从而降低生活质量。尽管骨组织具有一定再生能力,然而在很多情况下仍需要改善提高骨组织的修复能力。例如,大约 10%的骨折是不可自发愈合的进而导致骨组织再生不当或延迟愈合等[13]。这些骨折的愈合能力受年龄、代谢状况和创伤程度、面积的影响。老年人骨质疏松症引起的骨缺损和骨折的修复便是一项重大的临床挑战[14]。在欧洲每年有约 100 万名患者接受外科骨组织重建,此外有2750 万名患者接受骨质疏松症治疗[15]。据世界卫生组织报告,1995 年在美国用于治疗肌肉骨骼缺陷疾病的费用高达 2150 亿美元[16]。通过直接移植自体骨组织修补促进骨形成和诱导干细胞分化成骨细胞无任何免疫反应[17]是骨再生最有效的方法,但自体移植也面临着诸多局限,包括供体数量有限、再吸收、供区并发症、在特定区域失效和二次手术的风险[18]。而异体骨移植同样面临着供源短缺、免疫排斥反应等问题。因此组织工程学的诞生为骨缺损的治疗开辟了一条新的途径。工程骨组织的构建和制备方法如图 1.3 所示,将种子细胞生长因子和支架材料结合,并在体外构建后植入到患处,从而修复创伤骨组织。而构建组织工程骨的方式包括支架材料/成骨细胞、支架材料/生长因子、支架材料/(成骨细胞+生长因子)。理想的骨组织工程重点解决以下四个核心问题[19]:1. 制备可以模拟细胞外基质(ECM)结构的生物相容支架;2. 良好的成骨诱导性;3. 形态形成信号诱导理想型细胞的分化;4. 足够的血管网络以满足营养供给和组织空间。在骨组织工程中,支架材料占有尤为重要的位置。在骨修复初期,支架材料要提供临时的机械支持,并随着骨组织的再生逐渐降解并吸收。不可降解/不可吸收的支架会阻碍骨组织重塑的过程,进而延长恢复时间,因此可降解吸收聚合物是骨组织工程更倾向的支架材料。
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第 2 章 生物功能化改性支架的制备与表征
 
2.1 引言
PLGA 是脂肪族聚酯高分子家族的一员,因其良好的生物相容性、生物可吸收性、可调的生物降解性,被广泛应用于组织工程支架的制备。根据需要 PLGA 可以通过调整 LA 和 GA 的配比来调整降解时间,从一个月到六个月不等,其中常用的PLGA7525(LA/GA=75/25)的降解时间为 3-5 月,被用作骨组织工程支架材料[63, 185]。然而,PLGA 单一组分支架的机械性能不足、降解产物容易引起无菌性炎症、缺少成骨活性等问题有待解决。由于 HA 是天然骨组织中的主要无机组成,有良好的成骨活性、成骨诱导性、骨传导电位等优势,是良好的骨组织修复材料。有些学者将PLGA 与 HA 进行复合以增加支架材料的力学性能和成骨诱导性。HA 的引入可以缓解酸性降解产物带来的影响,同时增加支架材料的压缩强度[64]。天然骨组织具有良好的孔隙率和贯穿孔结构,以提供供细胞生存和扩增所需要的氧气、营养物质和代谢废物的传递和扩散,为此在制备骨组织工程支架的时候往往也会模拟这一特性。研究表明 200-300μm 的孔径是骨组织生长的最优尺寸,同时贯穿多级孔结构(微孔和大孔混合结构)较宏观的大孔结构展现出更好地支持细胞粘附性能[24]。此外,为了进一步提高 PLGA/HA 多孔支架的生物相容性和细胞亲和性,Col作为重要的天然骨组织有机成分被复合到多孔支架中,形成 PLGA/HA/Col。Mou等采用超临界 CO2发泡法制备了 PLGA/HA/Col 多孔支架,并采用 MG-63 细胞验证了此复合支架的生物相容性良好[186]。而实际上,Col 作为天然高分子,虽然具有优异的细胞亲和性和生物相容性,但它的降解速度快、力学性能差。因此在其使用上最理想的方式是将其作为表面改性大分子对PLGA/HA多孔支架进行改性以增加其细胞亲和性而不明显降低其力学性能。
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2.2 支架的制备
将 500 mg 胶原加入 50 mL PBS(pH=7.4)溶液中(10.0 mg mL 1),磁力搅拌 24 小时至胶原完全溶解。将干燥的支架置于安瓶内,加入 20 mL Col/PBS 溶液,抽真空使支架内部为负压,在负压作用下,胶原溶液完全浸入支架内部。此时 Col/PBS 溶液完全浸没支架材料。再将此安瓶置于震荡床上,频率 50 次/分钟,震荡 10 分钟。重复抽真空、震荡三次,使胶原均匀的覆于支架内部。然后将 Col涂覆的支架冷冻干燥 3 天备用。将戊二醛溶解在 PBS 中制备成 2.5%(v/v)的戊二醛溶液,置于 4℃冷藏储存备用。将 PLGA/HA/Col 和 PLGA/HA/Col/DGEA 两种支架置于 50mL 戊二醛溶液于 4℃反应 24 小时,然后将支架取出,分别用 PBS、去离子水洗涤三次。最后将支架冷冻干燥 3 天,4℃冷藏储存备用。
..........
 
第 3 章 多肽改性的复合支架的骨组织修复作用............53
3.1 引言.....53
3.2 实验部分......53
3.3 结果与讨论 ..........59
3.3.1 宏观效果观察 .........59
3.3.2 Micro-CT 扫描分析和三维重建 .......61
3.3.2 成骨相关的蛋白和基因的表达 ........64
3.3.3 免疫荧光观察 .........69
3.4 本章小结......72
第 4 章 全文总结 ..........73
4.1 全文讨论......73
4.2 不足及展望 ..........74
4.3 结论.....75
 
第 3 章 多肽改性的复合支架的骨组织修复作用
 
3.1 引言
骨组织工程作为骨缺损修复的重要领域,对骨缺损的治疗有着很好的前景。目前临床使用的人工骨是一些单纯的生物材料支架,如 PEEK,Ti,PLA 等,生物活性不高,组织细胞相容性较差,生物降解慢,甚至不降解,经常需要进行二次手术,给患者带来了痛苦和不便。加之人工骨的移植手术是一个复杂、受多因素的影响[199]。因此,开发并研用满足诸多生物要求的支架材料有着重要的意义。复合材料具有优异的三维结构和力学性能[20]。有研究报道,细胞与胶原之间的相互作用能够促进骨髓干细胞的成骨分化,同时胶原也能与许多生物分子和细胞因子发生反应,共同调节促进细胞的生长与分化[200]。DGEA 是一种胶原来源的短肽,具有明显的成骨作用,然而骨的再生是一个长期缓慢的过程,我们期望DGEA 作为缓释药物分子,能够持续的发挥着作用。在第二章,我们成功制备了 PLGA/HA/Col 和 PLGA/HA/(Col+DGEA)两种多孔复合支架。该支架具有良好的贯穿孔结构、亲水性、机械强度、和降解行为,但对成骨的作用还需证实。本章采用大鼠颅骨缺损模型,研究所制备的多孔复合支架对促进大鼠颅骨缺损处再生能力进行探讨。
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总结
 
虽然骨组织有一定的再生能力,但是在面对超出临界尺寸的缺损时,靠人体自身的修复能力很难达到修复的目的。目前临床上采用的骨修复材料主要为聚醚醚酮(PEEK)、钛合金(Ti)、生物陶瓷等,因其生物活性不高、组织细胞相容性较差、生物降解慢甚至不降解等,导致其治疗效果不佳,并常需要经二次手术取出,给患者带来了极大的生理和经济负担[242]。随着组织工程学提出的近 30 年来,骨组织工程的研究取得的长足的发展。骨组织工程支架具有良好的生物相容性、细胞亲和性、并可以随着新生骨组织的生长而降解吸收,不需要二次手术。众多材料被采用制备成骨组织工程支架以修复超临界尺寸骨组织缺损,主要包括天然高分子、人工合成高分子和可吸收无机生物陶瓷。为了更好的模拟天然骨组织的化学和结构组成,HA 和 Col 被广泛应用于骨组织工程支架的制备。而 Col 的降解速度快、力学性能差;HA 质脆、不易成型。因此脂肪族聚酯作为 FDA 批准用于临床的人工合成高分子被广泛的应用于骨组织修复。脂肪族聚酯具有良好的机械性能和可调控的生物降解性,但是其生物活性低。目前,主流是将三大类材料进行合理的复合,以发扬每一组分的优点、降低其缺点造成的不良影响。目前三类材料的复合通常是将三种材料进行共混,形成一种具有匀质的多孔支架材料。而从三类材料的性能我们可以发现,脂肪族聚酯具有优异的可控降解行为,良好的力学性能;HA 具有优异的成骨活性、骨诱导性、强度高;Col 具有良好细胞亲和性。理想的骨组织工程支架应该由脂肪族聚酯和 HA 构成骨架,表面涂覆 Col,这样既可以具有良好的力学性能和降解行为,又可获得良好的细胞亲和性。因此在本文中我们采用商用的 PLGA/HA 多孔支架为基础,并采用Col 进行表面改性,并以此为媒介负载 DGEA 以期望随着胶原的逐步降解,实现DGEA 的缓慢释放从而进一步促进成骨诱导分化。
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参考文献(略)
(责任编辑:gufeng)
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